 | |
| 図１．手法の概略 サバ類からＤＮＡを抽出し，コイとカエルの配列をもとに設計した４種類のプライマーを用いて18Ｓ〜ＩＴＳ１〜５.８Ｓ〜ＩＴＳ２〜28Ｓ領域（ａ），18Ｓ〜ＩＴＳ１〜５.８Ｓ領域（ｂ），５.８Ｓ〜ＩＴＳ２〜28Ｓ領域（ｃ）の３とおりのＰＣＲ増幅を行う。ａ領域のＰＣＲはｂとｃが正しく増幅されているか（産物長からみて矛盾しないか）確認のため。２種類のＩＴＳ領域を含む断片を電気泳動ゲルからそれぞれ切り出してプラスミドｐＵＣ19につないで大腸菌に組換える。１個体につきいくつかのクローンの配列を読んでＩＴＳ領域の塩基配列を決定。種間の比較を行い，種間差の認められる領域をさがす。その領域をＰＣＲで増幅して種判別を行う。今回は増幅断片の種間での長さの違いにもとづいて種判別した。 |